• Читателям
  • Авторам
  • Партнерам
  • Студентам
  • Библиотекам
  • Рекламодателям
  • Контакты
  • Язык: English version
234
Раздел: Биология
Постгеномная эра. Криоархивирование на примере  куницеобразных

Постгеномная эра. Криоархивирование на примере куницеобразных

В настоящее время кроме homo sapiens на Земле обитает еще около 4600 видов млекопитающих. Численность многих из них стремительно сокращается, о чем убедительно свидетельствует Красная Книга

Приведем один конкретный пример: из 37 видов семейства Felidae, лишь судьба домашней кошки не вызывает опасения. Ареал же диких видов кошачьих непрерывно сокращается, многие из них уже занесены в Красную Книгу. Почти столь же остро стоит проблема и в других семействах отряда хищных (Carnivora). Список исчезающих видов куницеобразных, а именно об этом семействе пойдет речь в этом разделе, тоже достаточно впечатляющий (Schreiber et al., 1989).

В связи с тем, что традиционные методы сохранения млекопитающих in situ или ex situ требуют больших финансовых затрат, все более популярными становятся криобанки, в которых можно сохранять генофонд этих видов (Амстиславский, 2006).

Детеныши, рожденные в результате трансплантации бластоцист европейской норки хонорику. Фото В. Циндренко

Другая причина резко возросшей в последнее время популярности методов репродуктивной биотехнологии заключается в том, что стремительное увеличение числа трансгенных и нокаутных линий мышей создает необходимость их архивирования. Уже существует около тысячи линий крыс и около десяти тысяч линий мышей (Abbott, 2004).

Большая часть этих линий создана в результате трансгенеза, мутагенеза или нокаутирования отдельных генов. Предполагается, что в течение следующих двух десятилетий общее число мышиных линий достигнет 300 000. По образному выражению А. Эбботт, генетики должны готовиться к «потопу» (Abbott, 2004). Зарубежные специалисты по лабораторным животным единодушны в том, что проблему резкого возрастания числа линий лабораторных животных можно решить путем создания криобанка для сохранения этих ресурсов. В настоящее время уже создана Международная федерация генетических центров, снабженных криобанками. В них сохраняют замороженные эмбрионы и сперматозоиды, из которых по мере надобности можно путем эмбриотрансплантации и (или) искусственного осеменения восстановить требуемую линию. В эту федерацию – FIMRe (Federation of International Mouse Resources) вошли ведущие центры Северной Америки, Западной Европы, Японии и Австралии.

В настоящей статье мы расскажем о наших исследованиях, выполненных в содружестве трех институтов (Института цитологии и генетики СО РАН, Института систематики и экологии животных СО РАН и Института прикладной биотехнологии университета г. Куопио, Финляндия) по разработке репродуктивно-биологических подходов и криотехнологий, направленных на консервацию исчезающих видов куницеобразных.

Работа по этому проекту изначально велась на хорьках и отчасти на горностаях. Цель первого этапа – показать, что эмбрионы куницеобразных способны переживать криоконсервацию при температуре жидкого азота, т. к. на момент начала проекта в мире не было ни одного позитивного результата. Более того, способ замораживания эмбрионов хищных млекопитающих вообще отсутствовал, была лишь одна успешная попытка: в 1988 г. Б. Дрессер с соавторами (США) получили живых котят из эмбрионов, которые хранились в криобанке (Dresser et al., 1988).

Слева: Морула европейской норки (Mustela lutreola) при световой микроскопии. Темный цвет обусловлен обилием липидных гранул, из-за которых большинство попыток получения потомства после криоконсервации зародышей хищных заканчивалось неудачей. Фото Е. Кизиловой. Справа: Развитие эмбрионов хорька в культуре in vitro после криоконсервации: а – эмбрионы хорька до замораживания. б – те же эмбрионы после криоконсервации. в – те же эмбрионы после четырех дней культивирования. г – На восьмой день культивирования один из зародышей прикрепился ко дну чашки Петри

Задача этого этапа – поиск и разработка адекватных способов получения эмбрионов куницеобразных и их трансплантации. В качестве экспериментальной модели выбран черный хорек (Mustela putorius) и его одомашненная форма – хорек фуро (Mustela putorius furo), которые являются ближайшими родственниками исчезающей европейской норки. Кроме того, первые эксперименты по криоконсервации эмбрионов проводились нами также и на эмбрионах горностая (Mustela erminea) (Amstislavsky et al., 1996; Кизилова и др., 1998).

На уникальной ферме куницеобразных, основанной супругами Терновскими в конце 1960 — начале 1970-х гг. в Академгородке (Ternovskaya et al., 2006), нами проведены успешные трансплантации эмбрионов между разными хорьками. Показательны эксперименты по трансплантации эмбрионов между хорьком фуро и черным хорьком. Однако неоднократные попытки получить живое потомство после пересадки эмбрионов хорька, прошедших полный цикл «замораживания—криоконсервации—размораживания», не привели к желаемому результату.

В этот период мы полностью осознали, насколько капризны эмбрионы хищных в плане их заморозки и почему подавляющее большинство попыток замораживания эмбрионов псовых и кошачьих заканчивались неудачей. Дело в том, что в эмбрионах хищных (Carnivora) содержится много липидных гранул, которые чувствительны к процедурам криоконсервации. В эмбрионах же лабораторных грызунов и большинства видов сельскохозяйственных животных этих гранул существенно меньше. Именно по этой причине во всем мире большинство попыток получить потомство после криоконсервации зародышей хищных заканчивались неудачей.

К этому времени у нас накопился достаточный опыт и в изучении репродуктивной биологии куницеобразных, и в практической трансплантации эмбрионов разных видов млекопитающих.Более того, к этому моменту мы разработали оптимальную биологическую модель трансплантации эмбрионов хорька. В связи с этим С. Я. Амстиславский был приглашен в Институт прикладной биотехнологии университета г. Куопио (Финляндия) для участия в проекте по трансплантации и криоконсервации эмбрионов хорька.

C. Я. Амстиславский проводит трансплантацию эмбрионов хорька, подвергавшихся замораживанию и криоконсервации. В результате трансплантации родилось живое потомство. Фото Хели ЛиндебергРанее автором было замечено, что основные (видимые в световой микроскоп) структурные нарушения эмбрионов хорька и горностая, подвергавшихся процедурам замораживания и криоконсервации, наступают лишь на этапе отмывки от криопротектора. Возникла идея исключить этот этап и сразу из соломины в среде, содержащей криопротектор, пересадить эмбрионы в матку реципиента. Сложность осуществления задуманного заключалась в том обстоятельстве, что глицерин и ДМСО (диметилсульфоксид), которые использовались в качестве криопротекторов при замораживании эмбрионов, очень токсичны. Помог счастливый случай. Именно в это время начинал «входить в моду» этиленгликоль, менее токсичный криопротектор, который мы и решили попробовать вместо ДМСО и глицерина. Кроме того, еще в Новосибирске, нами отрабатывалась процедура трансплантации эмбрионов в минимальном объеме среды. Это «ноу-хау» оказалось особенно важным теперь, когда мы решили трансплантировать эмбрионы непосредственно в матку, минуя этап отмывки от криопротектора.

Уже в самом начале финского этапа международного проекта удалось получить обнадеживающий предварительный результат. Мы показали, что эмбрионы хорька, прошедшие цикл «замораживания—криоконсервации—размораживания» с этиленгликолем, способны возобновить дальнейшее развитие в условиях in vitro вплоть до завершающего этапа – имплантации (Amstislavsky et al., 2000).

Вскоре нам удалось получить и живых хорчат после криоконсервации эмбрионов. Именно «трансплантация без отмывки» оказалась наиболее успешной. После «трансплантации с отмывкой» также родились хорчата, но их было намного меньше, чем при первом (инновационном) подходе (Lindeberg et al., 2003). Попутно мы подробно исследовали биологическую модель трансплантации эмбрионов у этого вида (Lindeberg et al., 2002). Изучили, сколько эмбрионов нужно пересаживать реципиенту, на какой день псевдобеременности, какова должна быть точность синхронизации донора и реципиента и т. д. Все это было очень важно для успеха проекта, т. к. из практики работы на разных видах млекопитающих, в том числе на лабораторных и сельскохозяйственных, нам было хорошо известно, чем больше имеется эмбрионов перед началом замораживания и чем эффективнее отработаны методы их трансплантации, тем выше шанс получить позитивный результат (Амстиславский и др., 1991).

После пресс-конференции в 2001 г., наша группа стала своего рода знаменитостью в Финляндии. Результат, так впечатливший журналистов, действительно интересный. На тот момент это был первый в мире успех криоконсервации зародышей вида, принадлежащего к отряду Carnivora, не учитывая опыт с зародышами домашней кошки. Фотографии хорчат опубликовали во многих газетах, в том числе и в Helsingin sanomat.

В дальнейшем мы возобновили эксперименты по эмбриотехнологии куницеобразных на базе фермы Терновских. Эти работы были поддержаны в 2002—2006 гг. совместным проектом Российской и Финской академиями наук. То, что экспериментальная активность по проекту вновь переместилась в Новосибирск, было связано с важным обстоятельством: в мире существует лишь четыре фермы, где в неволе разводят ближайшего исчезающего родственника хорька – европейскую норку. Еще каких-то 100—150 лет назад ареал его распространения простирался по всей Европе и даже доходил до бассейна р. Оби (Schreiber et al., 1989; Терновский, Терновская, 1994). К настоящему времени от этого ареала остались лишь три «островка», а именно: западная популяция в Пиренеях, южная популяция в дельте р. Дунай и северо-восточная популяция в России и Белоруссии.

Однако, несмотря на осознание проблемы научной общественностью и экологами, исчезновение этого вида продолжается.

Размножающиеся в неволе европейские норки становятся главным гарантом того, что этот вид полностью не исчезнет, и именно эти особи, способные размножаться в неволе, станут основой для изучения репродуктивной биологии данного вида и экспериментов по ре-интродукции в природу (Терновский, Терновская, 1994).

Европейскую норку разводят в неволе в Эстонии, Германии, Испании, но в новосибирском Академгородке это стали делать первыми в мире. И несмотря на то, что инвестиции в зарубежные фермы (особенно в недавно отстроенный центр в Испании) несравнимы с затратами на поддержание фермы Терновских, именно здесь плодовитость при размножении данного вида остается наиболее высокой по сравнению с зарубежными (Ternovskaya et al., 2006). Тиит Маран – один из лидеров в области сохранения европейской норки, руководитель центра в Эстонии, где этого зверя также разводят в неволе, и, пожалуй, один из самых авторитетных экспертов по этому виду в мире, не перестает этому удивляться!

Один из первых выводков, полученных в 1998 г. после трансплантации эмбрионов хорька, прошедших полный цикл «замораживание – криоконсервация – размораживание». Фото Хели Линдеберг

Именно на базе фермы Терновских, начиная с 2002 г., мы сосредоточились на изучении репродуктивной биологии европейской норки и разработке эмбриотехнологических подходов к консервации этого вида. Мы попробовали создать эффективную модель трансплантации эмбрионов гибридам европейской норки и хорька. Таких гибридов, носящих название хонорики и нохорики, в течение многих лет получают на ферме ИСиЭЖ СО РАН. Хонорики – гибриды самца хорька и самки европейской норки – впервые были получены супругами Терновскими (Терновский, Терновская, 1994). Этот метод широко вошел в практику, и сейчас слово «хонорик» уже никого не удивляет. Обратное скрещивание – самки хорька с самцом норки, – впервые осуществлено в 2001 г., и пока «нохорики» получены только на ферме Терновских (Ternovskaya et al., 2006).

Гибридизация хорька и норки может наблюдаться и в природе. Кстати, это явление считают одной из причин исчезновения европейской норки. Мы попытались обратить феномен гибридизации с хорьком во благо исчезающего вида и добились успеха.

В 2002—2004 гг. мы трансплантировали в общей сложности 56 эмбрионов норки девяти самкам хонорика. При этом родилось 28 детенышей. Кроме того, 16 эмбрионов европей­ской норки трансплантировали трем самкам нохорика, из которых родилось 8 норчат. Таким образом, при обоих типах трансплантации эффективность составила 50 %. (Amstislavsky et al., 2004, 2006).

Один раз мы пересадили самке хонорика 5 эмбрионов норки и 5 эмбрионами хорька. В итоге на свет появился выводок, состоящий из норчат и хорчонка. Этот результат так понравился редакторам журнала Reproduction Fertility and Development, что фотография этого выводка была вынесена на обложку журнала. (Amstislavsky et al., 2006)

И в самом деле, случай уникальный: родными, а точнее, единоутробными братьями и сестрами стали представители разных видов – хорька и норки.

Несмотря на эти успехи остаются еще важные проблемы, требующие решения. Так, например, эффективность криоконсервации эмбрионов куницеобразных остается пока низкой: лишь 11 % эмбрионов хорька подвергшихся «замораживанию—криоконсервации—трансплантации», развились в живых хорчат. Это гораздо ниже эффективности процедур трансплантации для лабораторных или некоторых сельскохозяйственных животных.

Кроме того, прямая трансплантация между европейской норкой и хорьком пока не приводит к рождению потомства. При попытках межвидовой трансплантации эмбрионов, даже между близкородственными видами чаще всего возникают проблемы, обусловленные различием гормональных и иммунных механизмов поддержания беременности у этих видов. Для преодоления межвидового барьера необходимо хорошо изучить их репродуктивную биологию (Ам­стиславский, 2006).

Реальный опыт применения репродуктивных технологий для сохранения генофонда. На примере куницеобразныхВ заключение хотим отметить, что в результате этого проекта впервые показана принципиальная возможность криоконсервации эмбрионов куницеобразных и создана модель трансплантации эмбрионов исчезающего вида – европейской норки. Следует отметить, что наши разработки высоко оцениваются. В 2003 г. на Первой международной конференции по сохранению европейской норки (Logrono, Spain) это направление было одобрено и получило официальное признание в резолюциях конференции.

В 2008 г. нами получен грант РФФИ (№ 08-04-49088) для изучения межвидового репродуктивного барьера между европейской норкой и хорьком и разработки подходов к его преодолению, и уже есть первые результаты (Amstislavsky et al., 2008). Эти успехи дают надежду на дальнейшее развитие этого направления, а также на то, что на базе изучения специфики репродуктивной биологии этого вида и его ближайших сородичей рано или поздно будет создан оптимальный пакет репродуктивных технологий, который позволит сделать криобанк эмбрионов одним из основных инcтрументов сохранения европейской норки.

Другим основанием для оптимизма является то, что американский сородич европейской норки, черноногий хорек (Mustela nigripes), который еще недавно считался исчезающим видом, и даже существовало убеждение, что он безвозвратно исчез, в настоящее время практически находится вне опасности (Grenier et al., 2007). А ведь именно серьезное изучение репродуктивной биологии этого вида куницеобразных, отработка методов разведения в неволе и ре-интродукции, а также применение репродуктивных биотехнологий как ключевого элемента всей программы обеспечило этот успех.

Литература

Амстиславский С. Я. и др. Методы биотехнологии в практике разведения животных. Новосибирск: Изд-во ИЦиГ, 1991. 170 с.

Амстиславский С. Я. Эмбриотехнологические подходы к сохранению исчезающих видов млекопитающих: дисс. д-ра биол. наук. Новосибирск, 2006. 265 c.

Кизилова Е. А. и др. Влияние криоконсервации на морфологию бластоцист хорька // Онтогенез. 1998. Т. 29. С. 1—8.

Терновский Д. В., Терновская Ю. Г. Экология куницеобразных. Новосибирск: Наука, 1994. 223 с.

Abbott A. Genetisists prepare for deluge of mutant mice // Nature. 2004. N. 432. 541 р.

Amstislavsky S. et al. Embryo cryobanking for conserving laboratory and wild animal species // Scand. J. of Lab. Anim. Science. 1996. N. 23. Р. 269—277.

Amstislavsky S. et al. Ex-situ preservation of Mustelidae: primer of application of genetic resource bank concept with the use of polecats as the model species // Scientifur. 2000. N. 24. Р. 45—58.

Amstislavsky S. et al. Transfer of European mink (Mustela lutreola) embryos into hybrid recipients // Theriogenol. 2004. N. 62. Р. 458—467.

Amstislavsky S. et al. Embryo development and embryo transfer in the European mink (Mustela lutreola), an endangered mustelid species // Reprod. Fertil. Dev. 2006. N. 18. Р. 459—467.

Amstislavsky S. et al. Conservation of the European Mink (Mustela lutreola): Focus on Reproduction and Reproductive Technologies // Reprod. Domest. Anim. 2008. N. 43. Р. 502—513.

Dresser B. L. et al. First successful transfer of cryopreserved feline (Felis catus) embryos resulting in live offspring // J. Exp. Zool. 1988. N. 246. Р. 180—186.

Grenier M. B. et al. Rapid population growth of a critically endangered carnivore // Science. 2007. N. 317. 779 р.

Lindeberg H. et al. Surgical transfer of in vivo produced farmed European polecat (Mustela putorius) embryos // Theriogenology. 2002. N. 57. Р. 2167—2177.

Lindeberg H. et al. Surgical recovery and successful surgical transfer of conventionally frozen-thawed embryos in the farmed European polecat (Mustela putorius) //Theriogenology. 2003. N. 60. Р. 1515—1526.

Schreiber A. et al. Weasels, Civets, Mongooses and their relatives. An action plan for conservation of Mustelids and Viverrids. USA: Kelvin Press, 1989. 99 р.

Ternovskaya Y. et al. Strategies for European mink preservation: International Conference on Conservation of European Mink. 5—8, 2003, Logrono, Spain, Proceedings Book // Gobierno de la Rioja, 2006. Р. 267—279.

Подробнее об этом

Статьи

Понравилось? Поделись с друзьями!

Подпишись на еженедельную e-mail рассылку!

comments powered by HyperComments
#
amstis@bionet.nsc.ru
д.б.н.
заведующий сектором криоконсервации и репродуктивных технологий ИЦиГ СО РАН

Институт цитологии и генетики СО РАН