Как писать и переписывать партитуру ДНК

Ыхправилкогданевшуткузанемогонуважатьсебязаставилилучшевыдуматьнемогегопримердругимнауканобожемойкакаяскукасбольнымсидетьиденьиночьнеотходянишагу прочькакоениз…

Конечно, каждый ходивший на школьные уроки литературы, узнает в этой длинной последовательности букв начало «Евгения Онегина». Но, боже мой, какой нелегкой была бы задача прочитать весь пушкинский роман без пробелов, точек и запятых, разбиения на строки и строфы! А если нужно не просто прочитать, а прочитать вслух и с выражением? И не знакомый со школы текст, а совершенно новый? А если стоит задача найти в этом тексте рифмы или определить стихотворный размер?

Здесь играть, здесь не играть, здесь рыбу заворачивали

Первые виды письменности в истории примерно так и выглядели. Несколько тысяч лет потребовалось людям, чтобы дойти до современных, привычных нам видов оформления речи на письме. И это еще не самая сложная ситуация, когда записанный текст требует пояснений для правильного чтения. Кто хоть сколько-нибудь времени посвятил изучению нотной грамоты, помнит диезы и бемоли, крещендо и диминуэндо и массу других специальных знаков, без которых записанные ноты невозможно сыграть так, чтобы получился Вивальди или Моцарт. «Здесь играть, здесь не играть, здесь рыбу заворачивали» – ​пересмотрите замечательную миниатюру В. Винокура и Л. Оганезова, там это очень хорошо объяснено.

Все сказанное имеет самое непосредственное отношение и к биологии. В каждой клетке нашего тела находится длинный «текст» ДНК, состоящий примерно из 6 млрд чередующихся «букв» А, Г, Т и Ц. В этом тексте записаны все инструкции по построению любой клетки человеческого организма. Так почему же, если текст везде одинаковый, в мозге по его инструкциям получаются нейроны, в печени – ​гепатоциты, а некоторые незаконопослушные клетки ухитряются стать раковыми? Ответ на поставленный вопрос краток и очень сложен. В каждой клетке, помимо текста ДНК, есть инструкции, как этот текст читать. Они могут быть записаны и в самой ДНК, и в белках, которые с ней связываются в клеточном ядре. А вот как эти инструкции работают – ​проблема настолько обширная и малопонятная, что в современной биологии считается одной из главных. Если последовательностями из четырех букв занимаются традиционная и молекулярная генетика, то инструкции – ​предмет отдельной дисциплины, эпигенетики, или «окологенетики», если частично перевести с греческого.

То, что мы сейчас знаем о наследовании генов и признаков организмов, во многом является следствием революции в молекулярной биологии, которая произошла в середине XX в. благодаря трудам Дж. Уотсона, Ф. Крика и десятков их коллег, чьи портреты украшают ныне учебники и сайт Нобелевской премии. Уже в то время стало ясно, что даже наследуемые признаки не всегда полностью определяются последовательностью нуклеотидов ДНК в геноме клетки или организма.

Например, в 50-х гг. прошлого века канадский генетик А. Бринк, работая с кукурузой, открыл явление, которое назвал парамутацией. Он брал растения с двумя разными аллелями гена red1, отвечающего за синтез пигмента и придающего зернам красную окраску. Один из этих аллелей дает темно-красные зерна, другой – ​более светлые. Побывав вместе со светло-красным аллелем в одном растении, темно-красный тоже становился светлым, не меняя при этом, однако, своей нуклеотидной последовательности. В итоге этих и многих других экспериментов возникло понятие о существовании двух взаимодополняющих систем наследственности: генетической, которая основана на последовательности нуклеотидов, и эпигенетической, основанной на стабильной активации и инактивации генов.

Парадоксально, но, несмотря на огромное и все возрастающее число публикаций, посвященных эпигенетике, единое определение этого понятия отсутствует. Некоторые ученые вслед за английским генетиком и эмбриологом К. Уоддингтоном понимают под эпигенетикой все, что происходит в организме при «реализации» генотипа – ​его проявлении во внешних признаках (фенотипе) в конкретных условиях среды. Другие специалисты, опираясь на авторитет не менее известных генетиков А. Риггса, Р. Холлидея и Дж. Мэйнард-Смита, более узко трактуют эпигенетику как наследование признаков, не связанных с различиями в последовательности ДНК. В любом случае до недавнего времени считалось, что эпигенетические механизмы отвечают за передачу информации дочерним клеткам о состоянии материнской клетки при ее делении, но лишь в исключительных случаях они задействованы в передаче информации из поколения в поколение у многоклеточных организмов.

Хороший, плохой, нейтральный

Сейчас известны два основных способа эпигенетической регуляции активности генов у животных и растений. Один из них основан на внесении модификаций в белки гистоны, образующие нуклеосомы – ​«катушки», на которые намотана ДНК в ядре клетки. Чем плотнее упакованы ДНК-белковые катушки в так называемый хроматин, тем меньше доступ к ДНК для ферментов, ведущих транскрипцию – ​синтез РНК по матрице ДНК. А чем меньше РНК – ​тем меньше белка производится, меньше активность гена.

Второй же способ основан на использовании особого основания ДНК – ​5-метилцитозина. От обычного цитозина он отличается наличием дополнительной метильной группы, чем становится несколько более похож на тимин – ​одно из обычных оснований ДНК. Но такие метилированные цитозины могут возникать не где угодно, а только если вслед за цитозином сразу стоит гуанин. Такие последовательности называются CpG-динуклеотидами. Если их в ДНК соберется много и близко друг к другу – ​получаются CpG-островки, чаще всего встречающиеся в районах промоторов – ​участков генов, с которых начинается их «чтение», т. е. транскрипция.

Обычно в нормальных клетках большинство CpG-динуклеотидов в геноме человека метилировано, а вот в островках, напротив, метилцитозин встречается редко. Зато во многих раковых клетках это распределение нарушено: островки больше метилированы, а остальные CpG-динуклеотиды – ​меньше. На самом деле метилцитозина в клетках так много, что иногда его даже называют «пятым основанием ДНК».

Каким же образом наличие 5-метилцитозина в ДНК влияет на активность генов? Своими кодирующими свойствами он от обычного цитозина ничем не отличается и прекрасно «прочитывается» при транскрипции. Зато метилцитозины, а точнее метилированные CpG-динуклеотиды, узнаются белками, содержащими так называемые метилсвязывающие домены (участки). После связывания с метилированной ДНК они привлекают другие белки, которые более плотно упаковывают хроматин, а это, как уже говорилось, мешает транскрипции.

До недавнего времени в этом механизме все казалось более-менее понятно: цитозин – ​«хороший», способствует активности генов, метилзцитозин – ​«плохой», ее подавляет. Но такие простые сценарии природе, как правило, не нравятся. Недавно была обнаружена «шестая буква» ДНК – ​5-гидроксиметилцитозин, об истории открытия которого мы поговорим чуть позже. К метильной группе у него добавлена еще гидроксильная, и это сильно отличает его от метилцитозина с точки зрения клетки: он узнается не теми же белками, что метилцитозин, а совершенно другими, которые не конденсируют хроматин, а, наоборот, делают его менее плотным. Так что в качестве «супермена» для повышения активности генов выступает именно гидроксиметилцитозин, а простой цитозин держит нейтралитет в этой вечной битве.

Пишем, стираем, пишем, стираем, пишем…

Любой сигнал на то и сигнал, что его можно включить и выключить, подать и отменить. Разумеется, если существуют специальные основания ДНК, меняющие активность генов, то один из главных вопросов – ​откуда они в ДНК появляются и куда потом пропадают?

С метилцитозином все стало понятно достаточно давно. Еще лет тридцать назад в клетках человека были обнаружены ферменты ДНК-метилтрансферазы, или метилазы, которых сейчас известно три – ​DNMT1, DNMT3a и DNMT3b. Они узнают CpG-динуклеотиды и снабжают их метильной группой. Три фермента играют немного разные роли. DNMT1 – ​«поддерживающая» метилаза. Если присмотреться, CpG-динуклеотид относится к палиндромным последовательностям, читающимся одинаково в обоих направлениях по комплементарным цепям. Поэтому метилцитозинов там не один, а два, и после репликации – ​копирования ДНК при делении клетки – ​нужно опять метилировать свеженький, только что встроенный в новую цепь ДНК цитозин, чем и занимается метилаза DNMT1. В отличие от последней, DNMT3a и DNMT3b могут метилировать ДНК «с нуля», даже если в ней еще нет метилцитозина. Внимательный читатель может спросить: а где же DNMT2? Есть такой белок, только он метилирует не ДНК, а РНК, и мы о нем говорить не будем.

Знакомство с белками, метилирующими ДНК, мы закончим упоминанием о том, что они существуют и у бактерий. Эпигенетической регуляции с участием 5-метилцитозина бактерии не изобрели, зато у них есть так называемые системы рестрикции-модификации, которые защищают их от вирусов. В бактериальной клетке, как правило, имеются ферменты-рестриктазы, разрезающие ДНК по определенным последовательностям, и метилазы, узнающие и метилирующие эти последовательности. Если в клетку попадает вирус, его ДНК разрезается, а бактериальная ДНК от этого защищена метилированием.

Разнообразие способов узнавания последовательностей и видов метилирования в мире бактерий велико, но некоторые из микроорганизмов, например спироплазма (симбиотический микроб, живущий в кишечнике насекомых), используют именно 5-метилцитозин в CpG-динуклеотидах. За это их очень любят ученые, поскольку в экспериментальных целях метилазу M.SssI из спироплазмы использовать не в пример легче, чем человеческие белки.

История со стиранием эпигенетических меток гораздо более запутанная. Долгое время полагалось, что клетка вообще этого не делает, а просто прекращает поддерживающее метилирование в каком-то месте генома, и через несколько клеточных делений большая часть потомков клетки не будет содержать метилцитозин в этом месте. Однако многие клетки в организме человека не делятся вообще, а убирать метильные метки способны. В других же случаях метилцитозин убирается из ДНК гораздо быстрее, чем позволяет клеточное деление. Поэтому когда наконец открыли систему активного деметилирования, все причастные к эпигенетике исследователи облегченно вздохнули. А механизм оказался крайне интересным.

Сами ломаем, сами чиним

О системе репарации ДНК «Наука из первых рук» писала неоднократно (Жарков, 2006; Ходырева, Лаврик, 2007; Жарков, 2009; Сидоренко, Гроллман, Жарков, 2013; Косова, Ходырева, Лаврик, 2013). Эта система помогает нам выживать, несмотря на десятки тысяч повреждений ДНК, которые каждая клетка нашего организма испытывает ежедневно как под влиянием внешних причин (ультрафиолетовые солнечные лучи, радиация, поступающие в организм токсины), так и за счет неизбежных биохимических процессов (главные «злодеи» тут – ​кислород и вода).

Самый важный из путей репарации, эксцизионная репарация оснований, начинается с того, что поврежденное основание узнается и вырезается из ДНК одним из ферментов, относящихся к классу ДНК-гликозилаз. Далее последовательно действуют еще несколько белков, и в результате на место поврежденной «буквы» ДНК встает нормальная.

Обычно про репарацию вспоминают именно в контексте борьбы с повреждениями ДНК, мутациями и раком. Однако несложно заметить, что такой конвейер ферментов идеально приспособлен для того, чтобы удалять из ДНК какие угодно модифицированные основания, а не только спонтанные повреждения. Инженер, перед которым была бы поставлена задача изобрести систему, удаляющую из ДНК метилцитозин, долго бы не думал: конечно, нужно сконструировать ДНК-гликозилазу, его вырезающую, а дальше репарация сама заделает дырку обычным цитозином. И инженер был бы не совсем неправ: именно по такому пути пошли растения, у которых тоже есть эпигенетическая система, использующая 5-метилцитозин.

Но у животных все организовано сложнее, и это лишний раз напоминает нам о различиях между инженером, активно использующим имеющуюся на плечах голову, и эволюцией, работающей по принципу «получилось бы хоть как-нибудь, а потом само усовершенствуется».Сначала метильная группа 5-метилцитозина окисляется одним из белков TET (их у человека три). При этом получается тот самый 5-гидроксиметилцитозин, который активирует гены. Если нам надо переключить ген из неактивного состояния в активное, мы достигли цели. А если нужно восстановить нейтральное состояние с цитозином, то ту же метильную группу можно окислить еще в два шага с образованием 5-формилцитозина и 5-карбоксилцитозина. Последние уже не активирующие и не ингибирующие и воспринимаются системой репарации как повреждения, которые она исправляет, в результате чего образуется цитозин. Заодно можно удалить аминогруппу бывшего метилцитозина и поменять ее на кетогруппу (проще – ​на атом кислорода). Этим занимаются несколько специальных ферментов-дезаминаз, и это тоже повреждение, которое удалит система репарации.

Можно сказать, что последние исследования в области эпигенетики изменили наш взгляд на ДНК. Школьная картина с четырьмя буквами сейчас представляется очень упрощенной: клетка для регуляции активности генов постоянно активно заменяет многие из этих букв на другие, не входящие в этот короткий алфавит. Уже сейчас ясно, что метилцитозином и гидрокисметилцитозином дело не ограничивается, и известны примеры, когда основания, ранее считавшиеся повреждениями, выполняют полезную функцию. Например, клетки нашей иммунной системы активно повреждают гены, кодирующие антитела – ​это помогает им быстро мутировать и перебирать много вариантов антител в поисках тех, которые будут узнавать вторгающиеся в наш организм патогены. Иногда специально поломать, а потом починить – ​очень эффективная стратегия замены старого на новое.

Подкрутить в нужном месте

Итак, мы знаем, как клетки ставят в ДНК и стирают из нее эпигенетические метки. Можем ли мы использовать это в своих интересах? Выключить активный онкоген в раковых клетках или, наоборот, подтолкнуть нужный неработающий ген?

Главный вопрос тут: как нацелить в нужное место генома белок, вводящий или стирающий эпигенетические модификации? И как раз в области такого нацеливания в последние годы произошла еще одна революция в биологии, которая сулит настолько большие перспективы в инженерии живых организмов, что сравнить ее можно, пожалуй, только с созданием ньютоновской механики, позволяющей инженерам проектировать прочные мосты и нетонущие корабли. Наш журнал писал и об этих достижениях, объединенных общим названием «геномное редактирование» (Власов, Пышный, Жарков, 2014, Медведев, 2014; Закиян, Власов, Медведев, 2014;), поэтому за деталями читателя мы отсылаем к этим статьям, а здесь упомянем только самое главное.

Сейчас существуют три главные системы нацеливания на нужное место в геноме. Одна основана на цинковых пальцах, широко распространенных белковых мотивах, узнающих небольшие кусочки ДНК. Комбинируя несколько «пальцев» с разными специфичными последовательностями ДНК, можно точно адресовать снабженный ими белок в уникальное место в геноме. По сходному принципу работает и так называемая система TAL-эффекторов, взятая из бактерий рода Xanthomonas, вызывающих многие болезни растений: небольшие участки белка, узнающие одну пару оснований, комбинируют для нацеливания на конкретную последовательность ДНК. Наконец, самая популярная на сегодня система, CRISPR/Cas9, для адресации использует последовательность РНК, соответствующую нужному участку ДНК. Если мы хотим нацелить РНК или белок ее на конкретный участок генома, мы делаем искусственный белок, в котором сочетается адресующий модуль, сконструированный на основе одной из упомянутых систем, и активный модуль, который будет, например, метилировать или деметилировать ДНК.

Справедливости ради стоит сказать, что самые первые попытки адресно воздействовать на метилирование ДНК вообще обходились без белков. Еще в 1990-х гг. в клетки научились вводить олигонуклеотиды – ​небольшие кусочки ДНК, содержащие метилцитозин в нужном месте, с расчетом на то, что они будут связываться с комплементарной ДНК, а система метилирования с помощью фермента DNMT1 примет это за последствия репликации и вставит в нужном месте ДНК метилцитозин. Это даже получалось, но в целом эффективность процесса была крайне низкой. 

В 1997 г. ученые наконец нашли первый подход к системам современного вида. В лаборатории Т. Бестора в Колумбийском университете (США) слили вместе адресующий модуль из цинковых пальцев и активный модуль в лице вышеупомянутой бактериальной метилазы M.SssI. Полученная конструкция в пробирке прекрасно метилировала ДНК в нужном месте. В 2003 г. М. Кладде из Техасского университета (США) сделал следующий шаг, испытав аналогичные адресованные гибридные метилазы в живых клетках, а именно в дрожжах, которые своей системы метилирования не имеют.

До появления систем адресации исследователи пытались как-то иначе с пользой изменять глобальный статус метилирования генома клеток человека и достигли на этом пути определенных успехов. В клинической онкологии для борьбы с лейкозами применяются лекарства азацитидин и децитабин – ​это аналоги цитозина, которые не могут быть метилированы, и в злокачественных клетках активируются убивающие их гены. Аналогичные подходы, только с другими лекарствами, используются при лечении серповидноклеточной анемии – ​заболевания, при котором мутирована одна из белковых цепей гемоглобина. При глобальном деметилировании запускаются гены фетальных глобинов. В норме у взрослого они уже работать не должны, но их активация помогает больному иметь хоть какой-то функциональный гемоглобин.

После того, как была показана принципиальная возможность нацеленного редактирования эпигенетических меток, новые варианты, использующие всевозможные адресующие и активные модули, посыпались как из ведра. Сейчас с помощью современных систем редактирования генома испытаны практически все известные ферменты систем метилирования и деметилирования. Но остается вопрос: а нужно ли это? Какое значение для клетки может иметь изменение метилирования в одном конкретном месте? Не окажется ли так, что для надежного изменения эпигенетических меток, регулирующих один ген, мы должны будем вводить в клетку десятки и сотни белков с разными адресами?

Пока кажется, что ответы на эти вопросы вполне оптимистичны. Еще эксперименты Кладде показали, что в дрожжах метилируется не только один конкретный участок, к которому адресована гибридная метилаза, но и CpG-динуклеотиды на несколько сотен нуклеотидов вокруг. В дальнейшем и другими группами ученых было показано, что и метилирование, и деметилирование как бы «расползаются» в стороны от места, куда было первоначально нацелено изменение. А в 2014 г., проанализировав огромное количество данных по метилированию и активности генов, международный консорциум, включающий и российских ученых, пришел к выводу о существовании того, что ученые назвали «светофорным метилированием»: примерно для 17 % CpG-динуклеотидов есть зависимость активности гена от состояния метилирования одного конкретного CpG.

Так что, похоже, управлять активностью генов вполне реально. Инженерия живых систем получила в свое распоряжение новый мощный инструмент.

Литература

Власов В. В., Пышный Д. В., Жарков Д. О. Приручение древней молекулы // НАУКА из первых рук. 2014. Т. 57/58. №3/4. С. 84–91.

Грин И. Р., Петрова Д. В., Жарков Д. О. Редактирование эпигенетических модификаций ДНК // Гены и клетки. 2016. Т. 11. № 2. С. 53–60.

Жарков Д. О. Загадки «ржавой» ДНК // НАУКА из первых рук. 2006. Т. 12. №6. C. 24–35.

Жарков Д. О. Часовые генома // НАУКА из первых рук. 2009. Т. 28. №4. C. 160–169.

Закиян С. М., Власов В. В., Медведев С. П. «Редакторы геномов». От «цинковых пальцев» до CRISPR // НАУКА из первых рук. 2014. Т. 56. №2. С. 44–53.

Косова А. А., Ходырева С. Н., Лаврик О. И. ДНК на замке // НАУКА из первых рук. 2013. Т. 53/54. №5/6. C. 14–21.

Медведев С. П. Как отредактировать наследственность // НАУКА из первых рук. 2014. Т. 55. №1. С. 10–13.

Сидоренко В. С., Гроллман А., Жарков Д. О. Токсикологический детектив, или Дело балканской эндемичной нефропатии // НАУКА из первых рук. 2013. Т. 53/54. №5/6. C. 22–33.

Ходырева С. Н., Лаврик О. И. Как клетка ремонтирует ДНК // НАУКА из первых рук. 2007. Т. 15. № 3. C. 82–89.

Goll M. G., Bestor T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases // Annu. Rev. Biochem. 2005. V. 74. P. 481–514.

Wu X., Zhang Y. TET-mediated active DNA demethylation: Mechanism, function and beyond // Nat. Rev. Genet. 2017. V. 18. N. 9. P. 517–534.