• Читателям
  • Авторам
  • Партнерам
  • Студентам
  • Библиотекам
  • Рекламодателям
  • Контакты
  • Язык: English version
313
Раздел: Биология
Кремниевые нанотехнологии «в пробирке»

Кремниевые нанотехнологии «в пробирке»

Кремний – один из самых широко распространенных химических элементов в земной коре – не входит в число основных элементов, слагающих живые клетки, а в высоких концентрациях даже токсичен. Тем не менее многие организмы, от губок и радиолярий до злаков, активно используют его для создания каркасных элементов своего тела. Среди самых искусных создателей структур из полимеризованного кремнезема –многочисленная и широко распространенная группа диатомовых водорослей. В своих «кремниевых нанотехнологиях» эти микроводоросли не используют экстремально высокие температуры и «тяжелую химию», поэтому они служат объектом пристального внимания современных биотехнологов

Умение диатомовых водорослей искусно манипулировать кремнием, которое эволюционировало и «оптимизировалось» десятки миллионов лет, в эпоху высоких технологий вызывает живейший интерес ученых. Термин «диатомовые нанотехнологии» (diatom nanotechnologies) ввел еще в 1988 г. американский исследователь Р. Гордон (Gordon, Aguda, 1988). Сейчас применительно ко всей группе пигментированных гетероконтов, к которым относятся не только диатомеи, но и хризофитовые, можно говорить о кремниевых нанотехнологиях (silicon nanotechnologies) в широком смысле (Grachev et al., 2008). Поэтому неудивительно, что макро- и микропроцессы морфогенеза и сама структура кремнеземных створок водорослей привлекают сегодня внимание специалистов из самых разных областей.

Диатомеи с разными типами симметрии панцирей: а – центрическая диатомея Stephanodiscus sp. радиальной симметрией; б – пеннатная бесшовная диатомея Fragilariavausheriae var. capucina с билатеральной симметрией; в – пеннатная шовная диатомея Achnantidium sibiricum с билатеральной симметрией

Благодаря своим оптическим свойствам и большой площади поверхности, на которой могут быть иммобилизованы антитела и ферменты, панцири диатомей могут использоваться в качестве биосенсоров (Gale et al., 2009; Sheppard et al., 2012). Недавно была показана возможность их применения для целевой доставки плохо растворимых в воде лекарственных препаратов, например, антираковых (Delalat et al., 2015).

Панцирь диатомеи состоит из двух перекрывающихся створок, соединенных друг с другом подобно мыльнице, соединяющих створки поясковых ободков

Среди всех одноклеточных организмов, создающих неорганические структуры микро- и наноразмера, диатомовые водоросли отличаются особенным многообразием форм. По типу симметрии панцирей диатомеи делятся на три основные группы: центрические с радиальной и биполярной симметрией (самая древняя группа) и пеннатные с билатеральной симметрией. Пеннатные, в свою очередь, подразделяются на шовные и бесшовные по наличию или отсутствию щели на створке

Панцири диатомей являются и объектом трибологии – науки, исследующей контактные взаимодействия твердых деформируемых тел при их относительном перемещении. При этом особое внимание привлекают способы объединения клеток водорослей в колонии с помощью соединительных кремнеземных конструкций и адгезивных веществ, которые они выделяют (Кроуфорд, Гибшубер, 2006, Gebeshuber, 2007). Диатомеи могли бы стать и экономичной заменой таких нанотехнологий, как планарная литография, которая используется для создания «плоских» полупроводниковых приборов, интегральных микросхем, а также некоторых сверхпроводниковых наноструктур. Один из этапов этой технологии – формирование в чувствительном слое на поверхности подложки рельефного рисунка, повторяющего топологию микросхемы. Вот если бы диатомее можно было «заказать» конкретный рисунок!

Пары соединенных створок сестринских клеток Cymatoseira. Фото Р.  М. Кроуфорд, И. Гибшубер

Эта мечта волнует многих – ее реализация могла бы стать основой принципиально новых биотехнологических производств. Однако несмотря на всю возможную пользу и экономическую выгоду, мы еще далеки от полного понимания генетических и клеточных процессов, лежащих в основе морфогенеза кремнеземного панциря диатомей, хотя эти исследования ведутся с середины прошлого века.

Ключевое звено – микротрубочки

Схема работы микротрубочек и паклитаксела. По: (Dumontet, Jordan , 2010)Кремнистая створка диатомовых водорослей формируется в специализированной внутриклеточной органелле – везикуле отложения кремнезема, окруженной специфической мембраной – силикалеммой. На сегодня известно, что важную роль в формировании створки играет цитоскелет, в частности, микротрубочки, которые у некоторых видов диатомей удалось визуализировать с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии. В экспериментах, где использовались вещества, ингибирующие работу микротрубочек (колхицин, люмиколхицин, оризалин и др.), водоросли формировали створки с разнообразными аномалиями.

В отделе ультраструктуры клетки Лимнологического института СО РАН была впервые в мире исследована роль цитоскелета в морфогенезе створки на синхронизированной культуре диатомовых водорослей, где все клетки находятся на одной и той же стадии клеточного цикла. Добиться синхронизации клеточных культур диатомей сравнительно несложно: для этого достаточно содержать их некоторое время в бескремниевой среде. Клетки сначала будут усиленно тратить свой запасенный кремний на построение панциря, а как только он весь израсходуется, они перестанут делиться и остановятся на определенной стадии жизненного цикла. При добавлении кремния в среду клетки вновь начинают процесс формирования новых створок и деления.

«Подопытной» стала диатомея Synedra acus subsp. radians – эта водоросль в течение нескольких лет служит в ЛИН СО РАН модельным объектом при изучении всех аспектов морфогенеза створки и хорошо размножается в лабораторной культуре. В экспериментах использовались два ингибитора работы микротрубочек с разным механизмом действия – колхицин и, впервые, паклитаксел. Колхицин блокирует сборку новых микротрубочек, связываясь с их растущими концами. Микротрубочки, которые подверглись деполимеризации, уже не могут восстановиться и вскоре разрушаются; при удалении колхицина из среды они восстанавливаются. Паклитаксел, напротив, блокирует деполимеризацию микротрубочек, связываясь с белком β-тубулином, что вызывает образование пучков микротрубочек.

Диатомовая водоросль Synedra acus. Световая микроскопия

Эксперименты на синхронизированной культуре синедры показали, что добавление колхицина в определенный момент морфогенеза позволяет получить новые кремнеземные формы с определенной структурой (Kharitonenko et al., 2015). Так, самое большое количество створок с неравномерными и непараллельными рядами ареол (отверстий) встречается при добавлении колхицина через 1,5 часа после начала морфогенеза створки, а самое большое количество искривленных створок – через 0,5 часа. Самое интересное – створки без ареол появляются, только если добавить колхицин через 2,5 часа после начала морфогенеза! Это справедливо и в отношении паклитаксела, причем при использовании обоих этих ингибиторов доля створок с аномалиями и характер изменений их морфологии зависит от стадии морфогенеза, на которой ингибиторы добавляют в среду с культурой водоросли.

В синхронизированной культуре клеток пеннатной бесшовной диатомовой водоросли Synedra acus при добавлении колхицина и паклитаксела увеличивается доля клеток с различными аномалиями строения кремнеземного панциря. В случае паклитаксела наблюдаются и такие редкие аномалии, как крупные отверстия в створке. Просвечивающая и сканирующая электронная микроскопия

6.08.jpg

6.09.jpg

Однако воздействие паклитаксела приводит к появлению и таких аномалий в строении створки, которые не наблюдаются в случае применения колхицина. Среди них – крупные отверстия в створке (единичные случаи), а также расширение створки, довольно часто встречающееся при использовании паклитаксела на начальных стадиях морфогенеза.

Как из «стаканчика» сделать «трубочку»

В культуре клеток центрической диатомовой водоросли Aulacoseira islandica при добавлении колхицина появляются сросшиеся дочерние створки, их кремнеземный панцирь приобретает вид «микротрубочки» вместо типичного для этого вида «микростаканчика». Вверху: створки без лицевой части. Конфокальная микроскопияСотруднице ЛИН СО РАН Надежде Волокитиной удалось выделить в лабораторную культуру еще один вид диатомовых водорослей – Aulacoseira islandica, доминирующий в байкальском фитопланктоне в определенные сезоны. Морфогенез этой диатомеи, в отличие от синедры, сравнительно мало изучен. У представителей рода Aulacoseira створка благодаря своему необычайно высокому загибу напоминает «микростаканчик», а клетки в колониях прочно скреплены особыми соединительными шипами.

Поскольку этот вид имеет тонкий панцирь, который сминается и разрывается при манипуляциях, при оценке воздействия ингибиторов на его морфогенез было решено использовать специальный флуоресцентный краситель, который встраивается в формирующиеся створки и позволяет наблюдать за результатом экпериментального воздействия в конфокальный микроскоп.

С помощью этой технологии удалось показать, что в присутствии колхицина в культуре появляются сросшиеся дочерние створки без перегородки, т. е. «микростаканчики» превращаются в «микротрубочки». Таким образом, если клетке на определенной стадии морфогенеза помешать соорудить «донышко» (лицевую часть створки), то она впоследствии продолжит строить загиб створки по запрограммированному сценарию, как если бы строители по какой-то причине не построили фундамент здания, а следующая бригада продолжила возведение стен или крыши.

Cегодняшние исследования механизмов формирования створок у диатомовых водорослей позволят в будущем использовать эти кремниевые бионанотехнологии на благо человечества, хотя сейчас мы находимся лишь в самом начале этого длинного пути. Не исключено, что дальнейшее изучение регуляции работы микротрубочек цитоскелета диатомей на клеточном и генетическом уровнях даст возможность получать культуры мутантных водорослей и «по заказу» создавать кремнеземные структуры с нужными характеристиками.

Вверху: нормальные «стаканчики» – очищенные кремнеземные створки A. islandica. Световая микроскопия. Внизу: 3D-изображение нормальной створки Aulacoseira islandica. Конфокальная микроскопия

Вверху: живая колония A. islandica из лабораторной культуры. Световая микроскопия. Внизу: 3D-изображение нормальной створки Aulacoseira islandica. Конфокальная микроскопия

Литература

Кроуфорд Р. М. Гибшубер И. Мини-наноинженеры // НАУКА из первых рук. 2006. № 4 (10). С. 48—54

Delalat B., Sheppard V. C., Ghaemi S. R. et al. Targeted drug delivery using genetically engineered diatom biosilica // Nature Communications. 2015. N. 6.

Dumontet C., Jordan M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics // Nat. Rev. Drug Discov. 2010 V. 9 P. 790–803.

Gale D. K., Gutu T., Jiao J., Chang C.-H., Rorrer G. L. Photoluminescence detection of biomolecules by antibody-functionalized diatom biosilica. Advanced Functional Materials. 2009. V. 19. P. 926–933.

Gebeshuber I. Biotribology inspires new technologies // Nano today. 2007. V. 2 N. 5. P. 30—37.

Gordon, R. & B. D. Aguda. Diatom morphogenesis: natural fractal fabrication of a complex microstructure // Harris, G. & C. Walker, Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Part 1/4: Cardiology and Imaging, 4—7 Nov. 1988, New Orleans, LA, USA, New York: Institute of Electrical and Electronics Engineers. 1988. V. 10. P. 273—274.

Grachev M. A., Annenkov V. V., Likhoshway Ye. V. (2008) Silicon nanotechnologies of pigmented heterokonts // BioEssays. 2008. V. 30. P. 328–337.

Sheppard V. C., Scheffel A., Poulsen N., Kröger N. Live diatom silica immobilization of multimeric and redox-active enzymes // Appl Environ Microbiol. 2012. V. 78 N. 1. P. 211–218.

В публикации использованы фото авторов

Понравилось? Поделись с друзьями!

Подпишись на еженедельную e-mail рассылку!